Асгардский бог Локи заключает сделку с повелителем инопланетной расы, известной как читаури: в обмен на Тессеракт (англ.)русск. — неиссякаемый источник космической энергии кубической формы — читаури предоставят Локи армию для захвата Земли. Ник Фьюри, директор агентства Щ.И.Т., прибывает на научную базу, где астрофизик Эрик Селвиг занимается исследованием Тессеракта. Селвиг и агент Мария Хилл сообщают Фьюри, что куб нестабилен и возможен выброс энергии. Объект активизируется, открывая портал, предоставляющий Локи путь на Землю. Он забирает Тессеракт и при помощи своего посоха получает контроль над Селвигом и несколькими агентами Щ.И.Т., среди которых Клинт Бартон. С их помощью Локи уходит, а портал взрывается, уничтожая базу.

Фьюри решает возродить отменённую ранее программу «Инициатива Мстителей». Агент Щ.И.Т. Наташа Романофф, более известная как Чёрная вдова, отправляется в Индию, где находит специалиста по гамма-излучению доктора Брюса Баннера. Хотя тот считает, что Щ.И.Т. хочет использовать его альтер-эго Халка в своих целях, он соглашается на предложение. Агент Фил Колсон навещает Железного человека Тони Старка и его помощницу и возлюбленную Пеппер Поттс, уговаривая Старка завершить исследования Селвига. Сам Фьюри посещает Стива Роджерса, который был первым американским супергероем — Капитаном Америкой — и со времён Второй мировой войны был заморожен на 70 лет. Герои прибывают на Хеликаррьер (англ.)русск. — летающий авианосец Щ.И.Т.

Локи засекают в Штутгарте. Пока Соколиный глаз похищает для него иридий, необходимый для стабилизации куба, Локи заставляет гражданское население присягнуть ему на верность, но Капитану Америке и Железному человеку удаётся взять его в плен. Во время транспортировки на них нападает Тор — сводный брат Локи и бог грома. Он пытается убедить брата вернуть Тессеракт и после недолгой стычки с Капитаном Америкой и Железным человеком понимает, что они преследуют те же цели, и присоединяется к команде. Локи доставляют на Хеликаррьер и помещают в предназначенную для удержания Халка камеру, пока куб не будет найден. Работая вместе с Баннером, Старк взламывает компьютеры Щ.И.Т. и обнаруживает разработки по использованию куба в производстве оружия на случай возможного вторжения. Роджерс находит вооружение, работающее на энергии куба, которое раньше использовала нацистская организация Г.И.Д.Р.А. (англ.)русск.. Старк и Роджерс обвиняют Фьюри во лжи, герои начинают ссориться, что чуть было не приводит к открытому конфликту. Чёрная вдова, пытаясь выторговать у Локи свободу Бартона, узнаёт, что он намеренно сдался команде, и его настоящий план — выпустить Халка. На авианосец нападают солдаты Локи и Соколиный глаз; они повреждают один из двигателей, который с трудом запускают Капитан Америка и Железный человек. Из-за аварии в Баннере просыпается Халк, которого пытается сдержать Тор, в результате чего Халк падает с корабля. Во время борьбы с Соколиным глазом Чёрной вдове удаётся ударом по голове снять с него контроль Локи.

Локи удаётся выбраться из камеры, заперев в ней Тора. Он смертельно ранит напавшего на него агента Колсона, сбрасывает Тора с авианосца и сбегает с Тессерактом. Фьюри использует смерть Колсона, чтобы мотивировать героев работать в одной команде. Старк и Роджерс понимают, что Локи нужно не просто победить их, а доказать своё превосходство перед человечеством, и догадываются, что он использует дуговой ядерный реактор башни Старка в Нью-Йорке, чтобы открыть портал читаури и начать завоевание Земли.

Мстители отправляются в Нью-Йорк, но не успевают помешать открытию портала и понимают, что не в состоянии сдержать силы агрессоров. Капитан Америка, взявший на себя обязанности полевого командира отряда, приказывает эвакуировать людей, в то время как прибывший Баннер превращается в Халка, помогает уничтожить корабли инопланетян, добирается до Локи и легко побеждает его. На крыше башни Старка Чёрной вдове и освободившемуся от внушения Локи профессору Селвигу удаётся взять портал под контроль при помощи посоха Локи. Между тем Комитет управления — начальство Фьюри — собирается уничтожить Манхэттен ядерными ракетами, чтобы остановить вторжение. Железный человек решает перенаправить снаряд прямо в портал к читаури. Ему удаётся, и ракета уничтожает главный корабль врагов, но сам Старк тоже оказывается по ту сторону ворот, где его костюм отключается. Он без сознания падает на Землю, где его ловит Халк, а Чёрная вдова закрывает портал. Герои спасли мир и получили всеобщее признание. Тор забирает Локи и Тессеракт в Асгард, а Фьюри разрешает Мстителям разъехаться, замечая, что когда человечеству будет угрожать новый враг, герои снова придут на помощь.

Роберт Дауни-мл. в роли Тони Старка / Железного человека:

В конце октября 2008 года Marvel выпустила пресс-релиз, в котором объявила о контракте с Робертом Дауни-младшим на участие последнего в четырёх фильмах студии, среди которых, помимо уже вышедшего к тому моменту фильма «Железный человек», значились ещё и «Железный человек 2», и «Мстители». Пресс-релиз спровоцировал появление мнения о том, что сюжеты «Железного человека 2» и «Мстителей» будут напрямую связаны. Сам Дауни-младший на тот момент ни с одним из сценариев сиквелов ознакомлен не был, но подобный ход допускал и он, считая, что второй фильм о Железном человеке должен вывести историю на новую ступень, при этом придерживаясь относительно реалистичного подхода, заданного в первом фильме. При первой же встрече Дауни-мл. с Уидоном (ещё на этапе доработки сценария) актёр пожелал, чтобы фильм начинался со сцены с его персонажем. Уидон сначала согласился, но затем предпочёл не акцентировать внимание на каком-либо отдельном персонаже, поставив в центре фильма саму команду супергероев. Что касается эволюции персонажа относительно предыдущих фильмов, то Дауни заявил, что «в „Железном человеке“, повествующем о становлении персонажа, он был сам для себя неким видом озарения и улучшения одновременно. В „Железном человеке 2“ речь шла о том, чтобы не быть одиноким островом, попутно решая проблемы с доставшимся наследством и местом для остальных… В „Мстителях“ он, как и все, от многого отказывается».

Крис Эванс в роли Стива Роджерса / Капитана Америки:

В марте 2010 года стало известно, что после многочисленных кастингов на роль Капитана Америки был утверждён Крис Эванс. Контракт на съёмки предусматривал не менее трёх фильмов (а также различных камео), в том числе фильмы «Первый мститель», находившийся на тот момент на этапе пре-продакшна, и «Мстители». По словам Эванса, в этом фильме Стив Роджерс гораздо мрачнее, что объясняется попытками героя «вписаться в современный мир», а также шоком, вызванным осознанием, что это уже «абсолютно другое время» и все, кого он знал, уже мертвы. Относительно взаимоотношений между Капитаном Америкой и Тони Старком Эванс отметил, что «он думает, что здесь определённо имеет место противопоставление персонажей», поскольку они «противоположны друг другу».

Марк Руффало в роли Брюса Баннера / Халка:

Гениальный учёный, который после воздействия гамма-излучения в стрессовых ситуациях превращается в огромного зелёного монстра. Руффало был выбран на эту роль после того, как предыдущий исполнитель роли, Эдвард Нортон, из-за разногласий со студией отказался сниматься в фильме. Когда речь зашла о замене Нортона, Руффало сказал: «Мы с Эдом друзья, и да, это не лучшее решение — оставить съёмки. Я вижу, что Эдвард решил оставить эту роль мне. Я смотрю на это как на „Гамлет“ моего поколения». Характер своего персонажа он видит так: «Он двухсторонний парень. Он и светлый, и тёмный, и всё, что он делает, контролируется властями. Этот человек может реально смотреть на своё злое воплощение — Халка. Мне нравится, что моя роль имеет эти качества». Что касается места Халка в команде, Руффало сказал: «Он как товарищ по команде, но ни один из участников не уверен, что он должен там находиться. Он как свободная пушка. Это как просто бросить гранату в середине группы, и будем надеяться, что всё будет хорошо!» Также в интервью журналу New York Руффало рассказал, что в отличие от прошлых фильмов, где Халк был сделан посредством компьютерной графики, он сыграет его по технологии захвата движения: «Я очень рад. Никто когда-либо не играл точно Халка, все делали из него CGI. Так что я на самом деле буду играть Халка. Это будет весело».
В оригинальной версии фильма Халка озвучил Лу Ферриньо.

Крис Хемсворт в роли Тора:

Асгардский бог грома, созданный на основе одноимённого персонажа скандинавской мифологии. Хемсворт, уже исполнявший роль Тора, также подписал контракт на несколько фильмов. Ранее актёр работал с Джоссом Уидоном в фильме «Хижина в лесу». Ещё для съёмок фильма «Тор» Хемсворту пришлось набирать мышечную массу, чтобы соответствовать своему персонажу; актёр признался, что «масса его тела по большей части протеиновая», и чтобы быть в форме для «Мстителей», он потреблял большое количество калорий, съедая каждый день куриные грудки, рыбу, стейк и яйца. По словам Хемсворта, в фильме Тор движим личными мотивами, так как за всем стоит его младший брат, Локи. Это легло в основу некоторых моментов о взаимоотношениях братьев, в то время как для всех остальных Локи — просто плохой парень, которого надо убрать.

Джереми Реннер в роли Клинта Бартона / Соколиного глаза:

Агент Щ.И.Т., высококвалифицированный лучник. Помимо стандартной программы тренировок, во время подготовки к фильму Реннеру пришлось учиться обращаться с луком. О своей роли актёр сказал: «Когда я посмотрел „Железного человека“, я подумал, что это по-настоящему отпадный подход к супергероям. Потом они мне рассказали о своём персонаже Соколином глазе, и мне понравилось, потому что он на самом деле не был супергероем — он просто парень-профессионал. Я мог бы подключиться к этому» Что касается снайперского мышления Соколиного глаза, Реннер отметил: «Это игра для одного. Он изгой. Он связан только с персонажем Скарлетт, Наташей. Это как левая и правая рука. Они сосуществуют, и оба нужны, особенно если дело доходит до физического задания».

Скарлетт Йоханссон в роли Наташи Романофф / Чёрной вдовы:

Опытный агент Щ.И.Т., русская по происхождению Наташа Романофф — бывшая преступница, а теперь — одна из самых искусных шпионов и убийц в команде Фьюри. О своём персонаже и об её отношениях с Клинтом Бартоном Скарлетт Йоханссон рассказала следующее: «У наших персонажей есть давняя история. В течение длительного времени они сражались вместе во многих битвах, и они — высококвалифицированные воины. У нас нет суперспособностей. Всё-таки Чёрная вдова, безусловно, является частью команды. Хотя среди актёрского состава она не просто ради романтического контраста или чтобы радовать глаз. Там она сражается, и потому у меня никогда не было ощущения, что я была единственной девушкой. Мы все обладаем определёнными умениями, и потому она чувствует себя на равных». По словам актрисы, у неё не было подобного опыта (за исключением фильма «Железный человек 2») участия в чём-либо масштабном, требующем многомесячной физической подготовки и тренировок, в которых принимали участие все актёры фильма.

Том Хиддлстон в роли Локи:

Сводный брат и враг Тора, основанный на одноимённом персонаже скандинавской мифологии. Об отличиях своего персонажа в фильме «Тор» и «Мстителях» Хиддлстон говорит: «Думаю, Локи, которого мы видим в „Мстителях“, продвинулся вперёд. Вы должны спросить себя: насколько это приятно, исчезнуть в тоннеле, созданном неким подобием супер-атомного взрыва, собственноручно сделанного им? Так что я думаю, к тому времени, когда Локи появляется в „Мстителях“, он кое-что увидел». О мотивах своего героя актёр добавляет: «В начале „Мстителей“ он прибывает на Землю, чтобы подчинить её, и его идея заключается в том, чтобы быть королём человеческой расы. И, как все помешанные диктаторы в человеческой истории, он считает это отличной идеей, так как если каждый занят поклонением ему, не будет войн, и путём тирании он создаст некий мир во всём мире. Но он заблуждается ещё и в том, что неограниченная власть добавит ему чувства собственного достоинства, потому я не выкинул из головы тот факт, что он по-прежнему движим той страшной ревностью и духовным отчаянием».

Сэмюэл Л. Джексон в роли Ника Фьюри:

Директор организации Щ.И.Т., который в предыдущих фильмах руководил программой «Инициатива Мстителей», предназначенной для вербовки героев в команду. Джексон заключил контракт на появление в девяти фильмах Marvel в роли Ника Фьюри, и «Мстители» стали для него пятым. По словам Джексона, его роль в «Мстителях» больше, чем в любом из предыдущих фильмов: «Вам не надо ждать окончания фильма, чтобы увидеть меня». О своём персонаже актёр говорит следующее: «Всегда приятно играть того, кто воспринимается положительно, а не отрицательно. Я постарался сделать его честным по отношению к сюжету и по отношению к тому, что могло бы быть в реальной жизни». Джексон сравнил Фьюри с Орделлом из фильма «Джеки Браун», назвав его «хорошим парнем, с которым можно приятно провести время».

Кларк Грегг в роли Фила Колсона:

Агент Щ.И.Т., работавший во многих отделах организации. Грегг также подписал контракт на несколько фильмов в рамках кинематографической вселенной Marvel и уже трижды появлялся в роли своего героя. В «Мстителях» его роль оказалась наиболее значительной — он ответственен за сбор всей команды вместе, что Грегг назвал «удивительным результатом того, к чему он двигался в течение пяти лет». Уидон расширил биографию персонажа, например, то, что он был поклонником Капитана Америки и собирал карточки с его изображением.

Коби Смолдерс в роли Марии Хилл:

Агент Щ.И.Т., работающая в тесном сотрудничестве с Ником Фьюри. Коби Смолдерс, которую Уидон рассматривал как одну из претендеток на главную роль в планировавшемся полнометражном фильме о Чудо-женщине, обошла во время кастинга нескольких актрис, среди которых была Морена Баккарин. Согласно условиям контракта, персонаж Смолдерс появится в девяти фильмах (включая камео). О своей подготовке к роли актриса сказала: «Я наняла замечательного инструктора спецподразделений, чтобы он взял меня на стрельбище, научил меня, как держать пистолет, драться, держаться, ходить и по большей части как смотреть. В фильме я не очень много дерусь, и поэтому мне не выделили тренера, но мне хотелось посмотреть, как бы я справилась».